A primeros de septiembre de 1504 era una evidencia la enfermedad de la reina Isabel. El año anterior la reina había recorrido buena parte de las principales ciudades de Castilla, y la fiebre y la depresión había prendido en su cuerpo y en su alma. Las desavenencias conyugales de su hija Juana, la constatación de su demencia y un infinito cansancio presiden la percepción de una muerte que se siente próxima. El 23 de septiembre, su marido requiere de la Universidad de Salamanca la presencia junto a los reyes de un jurista, y de un médico, para que asistan a un final que se presume inmediato. Hacía más de una semana que la reina no encabezaba ni firmaba las órdenes escritas de la monarquía, y la soledad de la firma del rey presagiaba un desenlace cuyo primer signo fue la incapacidad debida a la gravedad de la enferma.
La reina dictó testamento el 12 de octubre de 1504, ante su secretario y con la presencia de los obispos de Córdoba, Calahorra y Ciudad Rodrigo. La reina dictó un codicilo ante su secretario, y lo firmó delante de los obispos. Tres días más tarde, el 26 de noviembre, la reina moría en una casa de Medina del Campo. La noticia llegaba a Murcia y Cataluña una semana más tarde y, a los 15 días, ya se conocía en Navarra y en Roma. Tenía 53 años de edad, daba fin a casi 30 años de reinado y abría el camino a una herencia singular y un recuerdo imborrable.
La sencillez de la decisión acerca del destino de su cuerpo, y de los auxilios espirituales que necesitaba su alma contrasta con el conjunto de disposiciones políticas, que son la parte más importante del testamento y del codicilo: si el testamento revela la preocupación de la reina por corregir desequilibrios nacidos de la burocratización del Estado, de la presión nobiliar y de una constante que es la incertidumbre de la sucesión al trono, el codicilo se desarrolla para complementar aspectos descuidados en el testamento: privilegiar a la Iglesia en sus tres realidades más concretas del momento (obispados, Órdenes Militares, Santa Sede), lograr un eficaz funcionamiento de la justicia y ampliar la solidaridad con 20.000 misas más por las almas de los difuntos que le prestaron servicio.
A partir de 1504 Castilla padece una crisis que reproduce en buena parte contradicciones políticas preexistentes; frente a un aparente poder monárquico fuerte a la muerte de la reina, continúan insistiendo en sus reivindicaciones de privilegio las viejas aspiraciones de los grupos sociales más estanentalizados y las ciudades. Se reproducen en formaciones sociales partidistas que si bien no cuestionan con problemas de fondo la sucesión, si se polarizan en torno a los intereses de los personajes más directamente afectados: por un lado, la princesa doña Juana, archiduquesa de Austria y duquesa de Borgoña, casada con Felipe el Hermoso, heredera del trono castellano por la desaparición física de su hermano el príncipe don Juan; y de su hermana Isabel, casada con Manuel de Portugal; por otro lado, el rey Fernando, quien a la muerte de su mujer Isabel dejó de ser rey de Castilla, y a quien sin embargo se le reconoce en el testamento la gobernación del reino en ausencia de su hija doña Juana, que vivía en Flandes.
El 23 de enero de 1505, las Cortes de Castilla reunidas en Toro reconocían a su viudo como Gobernador de Castilla, hasta el momento en que regresase al reino doña Juana, a quien proclaman su reina aún con las reservas propias que inspiraba una enfermedad de la que ya se tenían noticias bien ciertas. Desde febrero de 1505 hasta mayo de 1506, Fernando el Católico se empeñó en una triple tarea cuyo objetivo final era preservar la unión de los reinos castellano y aragonés; frente a la oposición interna de buena parte de la nobleza castellana, que lo considera un extranjero, ayudado por los Procuradores en Cortes, por el aparato burocrático del Estado, por el clero y por los escasos miembros de la nobleza que lograron coaligar Cisneros y el Duque de Alba, el segundo empeño de Fernando fue asociarse al poder que representaba su yerno; el tercer empeño utilizó los recursos diplomáticos que permitieran un cambio en las relaciones con Francia y con el rey francés tras una posición recelosa respecto a la vecindad de los Habsburgo: Fernando el Católico se comprometió con Luis XII a contraer matrimonio con Germana de Foix y si nacía un hijo a titularle rey de Nápoles y de Jerusalén. El contrato matrimonial entre Fernando el Católico y Germana de Foix fue el resultado de una larga negociación. El 19 de octubre se celebró la boda por poderes, y el 18 de marzo de 1506 los recién casados se velaron en Dueñas.
La proximidad de las fechas ayuda a explicar la aceleración de la crisis; a fines de abril de 1506 Felipe el Hermoso desembarcó en La Coruña siendo recibido por la gran mayoría de la nobleza castellana, obligando en cierta manera a que Fernando abandone Castilla y se refugie en Aragón. El rey Fernando a primeros de septiembre parte hacia el reino de Nápoles. Días más tarde, el 25 de septiembre, moría en Burgos Felipe el Hermoso; fue el punto de partida de una serie de revueltas nobiliarias y del afloramiento de una serie de reivindicaciones territoriales, que dividieron a la nobleza en dos partidos; uno, más cercano a Cisneros, defendía el respeto al testamento de Isabel y, solicitaba a la vuelta de Fernando desde Nápoles para que se hiciese cargo de la gobernación del reino. El otro partido nobiliario, más próximo a las tesis políticas del desaparecido Felipe, defendía la entrega de la gobernación de Castilla a Maximiliano de Austria, que actuaría como regente hasta tanto su nieto Carlos no fuera proclamado rey de Castilla.
Existirán otros problemas, la formación de un tercer partido nobiliario en torno a Fernando, hermano de Carlos, que residía en Castilla, y que más adelante sería nombrado en el testamento de Fernando el Católico regente de Castilla y maestre de las Órdenes Militares, en el caso de que el reino quedase vacante, decisión que se modificó en enero de 1516 en beneficio de Cisneros, que sería regente hasta tanto no llegase el futuro emperador.
Los problemas más importantes continúan siendo la nobleza hostil a Fernando y partidaria de don Carlos y la incapacidad de la reina doña Juana. Juana, apodada la Loca, vera cuestionada su posibilidad de gobernar; la certeza de una enfermedad, más declarada y agravada a partir de la prematura muerte de su marido, Felipe el Hermoso, convirtió a la reina en una reclusa encerrada en Tordesillas desde 1509 por orden de su padre. Aparte de las evidencias de la incapacidad debida a la enfermedad, existió una pugna por el control del ejercicio del poder y una separación efectiva de la reina de los asuntos del Estado, que primero fue decidida por su marido, después por su padre y, más tarde, por su hijo Carlos quien, el 14 de marzo de 1516, se proclamaría rey de Castilla y Aragón en su residencia de Bruselas, una vez conocido el fallecimiento del Rey Católico, ocurrido el 23 de enero de 1516 en el pequeño lugar extremeño de Madrigalejo.
Nominalmente la reina doña Juana continuó figurando en los documentos reales, aunque hacía mucho tiempo que había sido apartada del poder y, contra lo dispuesto en el testamento de Isabel la Católica, existieron suficientes intereses y tensiones como para poner en peligro una compleja herencia familiar.
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